СТРЕПТОМИЦЕТЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С МОКРИЦАМИ ARMADILLIDIUM VULGARE И PORCELLIO SCABER

ВВЕДЕНИЕ

Данная тема связана с поиском новых антибиотиков, что актуально в настоящее время из-за быстрой адаптации и возникновению резистентности микроорганизмов к противомикробным препаратам.

Почва населена разнообразными микроорганизмами. Особый интерес представляют те, которые ассоциированы с беспозвоночными животными, так как именно при совместном взаимодействии они проявляют повышенную физиологическую активность. Отмечается симбиоз актиномицетов с беспозвоночными, а также их повышенная антибиотическая деятельность, что касается и мокриц (Dayana da Silva Correia и др, 2018) [2].   

Наземные изоподы являются одной из основных групп почвенных беспозвоночных, о которых весьма мало известно. Мокрицы являются группой крупных беспозвоночных, участвующих в деструкции органического вещества и играющих значительную роль в процессах почвообразования (Ахади и др., 2019)[1].

Мокрицы влияют на микрофлору почвы, поскольку почвенные беспозвоночные во многом определяют протекание почвенных процессов: разложение органического вещества, реутилизацию микробной биомассы, миграцию и мобилизацию биогенных элементов, за счет селективного поедания одних микроорганизмов и способствуют размножению других. Известно, что кишечник и экскременты почвенных беспозвоночных обладают высокой микробиологической активностью и разнообразием (Konschak и др., 2020) [3].

Цель данной работы – изучить таксономический состав и антибиотическую активность мицелиальных актинобактерий, ассоциированных с мокрицами Armadillidium vulgare и Porcellio scaber

В задачи исследования входило: (1) Учет мицелиальных актинобактерий, выделенных из тела, из содержимого кишечников и поверхности мокриц (2) Сравнительное изучение антибиотической активности кишечных изолятов актиномицетов по отношению к почвенным микроорганизмам (3) Отбор активных штаммов и их видовая идентификация (4) Создание коллекции штаммов.

 

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Объекты

Для исследования использовали чистые культуры мицелиальных актинобактерий рода Streptomyces, которые были выделены из ассоциаций с почвенными беспозвоночными животными, а именно мокрицами Porcellio scaber и Armadillidium vulgare.

Мокрицы отобраны с деревьев и почвы на территории почвенного стационара Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

В процессе настоящего исследования определялась таксономическое разнообразие актинобактерий ассоциированных с мокрицами и антибиотическая активность выделенных актиномицетов по отношению к тест-организмам: Arthrobacter globiformis, Bacillus subtilis, Myxococcus sp., Erwinia sp., Chromobacterium sp., Micrococcus sp., Pseudomonadaceae рода Xanthomonas sp., Rhodococcus erythropolis.

Методы

1) Актиномицеты выделялись из мокриц методом истощающего посева (штриха). Для микробиологического выделения использовался Лабораторный вортекс. Беспозвоночные помещались в пробирки с чистой водой 10 мл и под действием прибора встряхивались со скоростью 10 000 оборотов в минуту в течение 10 минут, далее делали разбавление в 10^1. Мокрицы взвешивались, извлекался кишечник, который гомогенизировался и разбавлялся в пробирке с 4 мл чистой водой. Потом переносилось 50 мкл исследуемого материала на чашку Петри со средой Гаузе-1, и стеклянным шпателем образец распространялся по всей чашке. Далее этим же шпателем было необходимо растереть остатки материала по 2 чашкам Петри. Те же действия совершались для исследования микробиологического фона тела и поверхности мокриц. Состав среды Гаузе-1 (г/л): 30 г агара, 20 г растворимого крахмала, 0,5 г NACL, 1 г  KNO3, K2HPO4 0,5 г, 0,5 г  MgSO₄ ∙ 7H₂O, следы FeSO₄ ∙ 7H₂O, рН 7,0-7, 1 л H2O, нистатин 500 мг/л

2) Таксономическую идентификацию актиномицетов проводили по определителю Гаузе [4] и бактерий проводился по определителю Гаузе с использованием диагностических сред: (1) Среда Гаузе I (минеральный агар (2) Среда Гаузе II (органический агар 2) (3) Овсяный агар (4) Глицерин-нитратный агар (5) Пептонно-дрожжевой агар с железом. Для оценки антибиотической активности актиномицетов использовался метод агаровых блочков. Агаровые блоки помещались на среду RICH, с выращенными на ней вышеперечисленными тест-культурами. Состав среды RICH г/л: сахароза 1 г; дрожжевой экстракт 1 г; гидролизат казеина 1 г; CaCO3 1 г; пептон 2 г; глицерин 10 г; агар 20 г.

3) Мокрицы определялись до вида по морфологическим признакам. Использовались определительная таблица «Определитель мокриц (ISOPODA: ONISCIDEA) Ростовской области», а также Руководство по идентификации наземных изопод Мэриленда, США (ракообразные) Джеффри В. Шульца.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Было проведено 6 посевов. Суммарно посеяно 15 мокриц Armadillidium vulgare и 14 Porcellio scaber на среду Гаузе-1 методом истощающего посева. Посевы были произведены из целых кишечников, тел и поверхности мокриц Armadillidium vulgare и Porcellio scaber.

Исходя из рассчитанных КОЕ по массе мокриц получено, что актиномицеты не являются доминирующей группой в отличие от других групп бактерий (таблица 1).

Таблица 1. Численность бактерий, выделенная из кишечников, тел и поверхности мокриц Armadillidium vulgare и Porcellio scaber.

Среди выделенных актиномицетов, абсолютно преобладал род Streptomyces. В отобранной почве преобладала секция Albus (55%) , на поверхности мокриц доминирующей секцией являлась Helvolo-Flavus (77%). В тканях тела же доминировала секция Cinereus (68%), а в кишечнике не было выраженного преобладания какой-либо секции (таблица 2).

Табл. 2. Таксономическое разнообразие видовых секций и серий рода Streptomyces,   выделенных из почвы, покровов, тела и кишечника мокриц.

Антибиотическая активность

Выделено 46 штаммов стрептомицетов. Из ассоциаций с изоподами выделено 18 штаммов стрептомицетов, которые были проверены на антибиотическую активность в 3 повторностях на 8 тест-культурах: Arthrobacter globiformis; Bacillus subtilis; Myxococcus sp.; Rhodococcus erythropolis; Erwinia sp.; Chromobacterium sp.; Micrococcus sp.; Xanthomonas sp. Из 18 выделенных штаммов, 7 показывали зону лизиса больше 10 мм, что говорит о выраженной антибиотической активности ( таблица 3). Ни один из штаммов актиномицетов не подавлял рост Erwiniasp. Возможно, это связано с тем, что протеобактерии образуют ассоциации с изоподами.

 

Табл. 3. Антибиотическая активность (мм), штаммов актиномицетов, по отношению к  тест-культурам:

На фотографиях из рисунка 1 видны примеры, как визуально выглядит зона подавления актинобактерий по отношению к тест-культурам, а в таблице 4 указаны виды штаммов.

Рис. 1. Зоны подавления роста тест-культур

 

Табл. 4. Видовая идентификация актиномицетов

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итогам статьи можно прийти к выводу, что доминантами актиномицетного комплекса на поверхности изопод являлись стрептомицеты секции Helvolo-flavus. Остальные секции были в меньшинстве. В теле изопод доминировала секция Cinereus. В кишечнике секции были без значительных преобладаний какой либо секции. В  отобранных образцах почвы доминировала секция Albus. Эти данные подтверждают, что мокрицы являются локусами микробиологического разнообразия. Из ассоциаций с изоподами было выделено 18 штаммов стрептомицетов из них 7 – обладали высокой антибиотической активностью с диаметром подавления более 13 мм на тестовых культурах. В последующем, была составлена коллекция штаммов актиномицетов, выделенных из ассоциаций с изоподами.