СОВРЕМЕННЫЕ ДАННЫЕ О ВИРУСОЛОГИИ И ЖИЗНЕННОМ ЦИКЛЕ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С

Актуальность исследования: Вирус гепатита С (ВГС) - это позитивный одноцепочечный РНК-вирус семейства Flaviviridae. Он вызывает острый гепатит с высокой склонностью к хронической инфекции. Хроническая инфекция может прогрессировать до тяжелых заболеваний печени, включая цирроз и гепатоцеллюлярную карциному. За последние десятилетия наше базовое понимание вирусологии и жизненного цикла ВГС значительно продвинулось с развитием систем культивирования и репликации клеток. Наша способность лечить вирус гепатита С также была улучшена при комбинированном применении интерферона, рибавирина и низкомолекулярных ингибиторов вирусно кодируемой протеазы NS3/4A, хотя необходимы лучшие терапевтические варианты с большей противовирусной эффективностью и меньшей токсичностью. В этой статье мы рассмотрим различные аспекты жизненного цикла ВГС, включая прикрепление вируса, вхождение, слияние, трансляцию вирусной РНК, посттрансляционный процессинг, репликацию ВГС, сборку и высвобождение вируса. Каждый из этих этапов обеспечивает потенциальные мишени для новой противовирусной терапии для лечения и предотвращения неблагоприятных последствий прогрессирующего заболевания печени.

Цель нашей работы заключается в анализе интернет ресурсов о последних достижениях в вирусологии и клеточной биологии жизненного цикла вируса гепатита С.

Обнаруженный в 1989 году [6], ВГС представляет собой одноцепочечный РНК-вирус позитивного смысла семейства Flaviviridae, который также включает в себя многие переносимые членистоногими человеческие патогены рода Flavivirus, такие как вирус желтой лихорадки, вирус Западного Нила и вирус денге. Изоляты ВГС были сгруппированы в семь генотипов и ряд подтипов [11] с различными географическими распределениями и чувствительностью к лечению на основе интерферона [12, 13]. Единственной настоящей животной моделью ВГС является шимпанзе, которая сыграла решающую роль в исследованиях иммунитета и патогенеза ВГС [14]. Кроме того, также были разработаны химерные модели человеческой печени и генетически модифицированные модели мышей, устойчивых к ВГС [15]. Долгое время отсутствие системы культивирования клеток было серьезным препятствием для изучения жизненного цикла ВГС. Однако системы селектируемых репликонов [16] и псевдотипированные частицы на основе ретровирусов были основными инструментами для понимания геномной репликации ВГС и проникновения вируса соответственно. Наконец, с 2005 года полный жизненный цикл вируса может быть исследован с помощью полных систем репликации вируса [18, 19, 20]. Следует отметить, что в этих системах культивирования клеток обычно используются клетки гепатомы, полученные из HuH-7. Однако этой клеточной линии недостаточно много особенностей гепатоцитов [21]. Поэтому были разработаны первичные гепатоциты человека или срезы печени человека для проверки некоторых экспериментов на более физиологических моделях [22, 23, 24].

Ядро ВГС - это вирусный нуклеокапсидный белок с многочисленными функциональными возможностями, включающими связывание РНК, иммунную модуляцию, клеточную сигнализацию, онкогенный потенциал и аутофагию. Основной белок ВГС также связывается с липидными каплями, где также происходит сборка ВГС. E1/E2-это гликозилированные гликопротеины оболочки, которые окружают вирусные частицы. Оболочка ВГС нацелена на нейтрализующее вирус давление отбора антител с высокой степенью вариации последовательности, что может сделать ответы антител неэффективными и способствует персистенции ВГС.  Белок малого ионного канала р7 находится ниже по течению от области оболочки и необходим для сборки и высвобождения вируса. 

NS2-это вирусная аутопротеаза, которая играет ключевую роль в вирусной сборке, опосредуя расщепление между NS2 и NS3. NS3 кодирует N-концевую сериновую протеазу ВГС и С-концевую РНК-геликазу-NTPase. Протеаза NS3 играет критическую роль в процессинге ВГС. Он также расщепляет адапторный белок TLR3 TRIF и митохондриальный противовирусный сигнальный белок MAVS, тем самым блокируя путь индукции ИФН I типа в клетках [23]. NS3 является одной из ключевых мишеней для разработки противовирусных препаратов против ВГС. NS4A образует стабильный комплекс с NS3 и является кофактором протеазы NS3. Роль NS4B до конца не изучена, хотя известно, что он индуцирует образование мембранного полотна. NS5A представляет собой димерный цинк-связывающий металлопротеин, который связывает вирусную РНК и различные факторы хозяина в непосредственной близости от ядра ВГС и липидных капель. Ингибиторы ВГС NS5A проявили противовирусный эффект у пациентов и находятся в быстром клиническом развитии. Наконец, NS5B-это РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp), которая также активно используется для разработки противовирусных препаратов. В совокупности эти белки также вносят вклад в различные аспекты жизненного цикла ВГС, включая прикрепление вируса, проникновение и слияние, трансляцию РНК ВГС, посттрансляционный процессинг, репликацию ВГС, сборку и высвобождение вируса.

Вирусная частица ВГС включает геном РНК, ядро и гликопротеины оболочки, E1 и E2 [2]. Геном РНК ВГС взаимодействует с белком ядра с образованием вирусного нуклеокапсида в ассоциации с цитозольными липидными каплями (cLD). Вирусный нуклеокапсид окутан богатой липидами вирусной оболочкой с гликопротеинами Е1 и Е2, которые играют ключевую роль в проникновении вируса через связывание рецепторов и слияние [24,25]. Гликопротеины Е1/Е2-это трансмембранные гликопротеины I типа, которые могут образовывать нековалентные гетеродимеры внутри инфицированных клеток или большие ковалентно связанные комплексы на вирусной частице. Они включают большой N-концевой эктодомен и короткий С-концевой трансмембранный домен. Трансмембранные домены участвуют в закреплении мембраны, локализации эндоплазматического ретикулума (ЭР) и гетеродимеризации гликопротеинов оболочки[26-28]. Е1 и Е2 сильно гликозилированы, содержат до 6 и 11 сайтов гликозилирования соответственно[29].

В гликопротеине оболочки Е2 были выявлены гипервариабельные области. В частности, гипервариабельная область 1 (HVR1) представляет собой сегмент длиной 27 аминокислот основных остатков с высокой степенью вариабельности последовательности, а также высококонсервативной конформацией,что предполагает роль нейтрализующего HCV эпитопа и участие в факторе входа хозяина[31-33]. Вирион ВГС также ассоциируется с различными липопротеинами, такими как apoE, apoB, apoC1, apoC2 и apoC3 с образованием сложных липовирочастиц (LVP) и различных липопротеиновых компонентов могут влиять на проникновение. 

Проникновение вируса в клетку-хозяина включает в себя сложную серию взаимодействий, включая прикрепление, проникновение и слияние. Первоначальное прикрепление вируса к его рецептору/ко-рецепторам может включать HVR1 в ВГС E2 [35,36] с облегчением гепарансульфатными протеогликанами, экспрессируемыми на поверхности гепатоцитов [37-40]. В то время как рецепторы ЛПНП могут связывать ВГС и способствовать его проникновению в клетки, [41] Взаимодействие ВГС-ЛПНП может быть непродуктивным и потенциально приводить к деградации вирусных частиц [40]. После присоединения к входящим факторам ВГС интернализуется в клетки-мишени посредством рН-зависимого и клатрин-опосредованного эндоцитоз [42-45]. 

Были идентифицированы множественные клеточные рецепторы и факторы входа для HCV, включая мусорные рецепторы класса B типа I (SRB1) [46]  и CD81 [47], а также белки плотного соединения, клаудин-1 (CLDN1) [48]  и окклюдин (OCLN) [49,50]. Дополнительные недавно идентифицированные факторы входа включают рецепторные тирозинкиназы (RTK) рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), рецептор эфрина A2 (EphA2) [51] и рецептор поглощения холестерина Niemann-Pick C1-like 1 (NPC1L1) [52]. 

Человеческий CD81-это молекула тетраспанина, которая широко экспрессируется и участвует во многих клеточных функциях, включая адгезию, морфологию, пролиферацию и дифференцировку. Он включает в себя 4 трансмембранных домена, 2 коротких внутриклеточных домена и два домена внеклеточной петли (малый и большой) [54]. CD81, вероятно, вовлекается после очень ранней фазы проникновения ВГС (т.е. После SRB1), способствуя конформационному изменению гликопротеина оболочки ВГС E1/E2 для облегчения низкого рН-зависимого слияния и вирусного эндоцитоза [61]. Недавно также было высказано предположение о вовлечении в более позднюю фазу после интернализации вируса [62].  CD81 большая внеклеточная петля связывает ВГС через его оболочку гликопротеин Е2 [47,63]. Последовательность большой внеклеточной петли CD81 сохраняется между людьми и шимпанзе, единственными видами 2, пермиссивными к инфекции ВГС in vivo [64,65]. Однако CD81 от других видов (например, африканская зеленая обезьяна, тамарин, крысы, мыши, хомяк) может поддерживать вход клонов ВГС in vitro, предполагая, что полиморфизм CD81 недостаточно для определения восприимчивости к ВГС. Хотя повсеместная экспрессия CD81 в нескольких типах клеток может ограничивать целенаправленное терапевтическое применение, было показано, что анти-CD81 ингибирует проникновение ВГС in vivo в химерную мышиную модель репликации ВГС [67].

Было показано, что два белка с плотным соединением (CLDN1 и OCLN), идентифицированные с помощью скрининга библиотеки кДНК на наличие клеточных факторов, которые обеспечивают инфицирование псевдочастицами HCV, являются важными факторами входа для ВГС [48,50]. Интересно, что ни CLDN1, ни OCLN, по-видимому, не взаимодействуют непосредственно с частицами ВГС. Однако CLDN1 может взаимодействовать с CD81 как часть рецепторного комплекса ВГС [68,69] считается, что CLDN1 и OCLN участвуют в более поздней фазе проникновения ВГС, после SRB1 и CD81, хотя их точные роли полностью не определены. Было также показано, что гликопротеины оболочки ВГС способствуют коэндоцитозу CD81 и CLDN1 в клатрин - и динамин-зависимом процессе [62]. Наконец, было показано, что моноклональные антитела против CLDN1 ингибируют ВГС -инфекцию в гепатоцитах in vitro путем нейтрализации взаимодействий между ВГС E2 и CLDN1 [70,71].

Два RTK, включая EGFR и EphA2, были недавно идентифицированы как факторы входа в ВГС с помощью функционального рнккиназного скрининга [51]. Эти RTK, по-видимому, участвуют в проникновении ВГС после начальной стадии прикрепления/связывания, регулируя взаимодействие CD81 и CLDN1 ко-рецепторов и слияние мембран. РТК также способствовали межклеточной передаче ВГС. Что касается клинического применения, то инфекция всеми основными генотипами ВГС и вариантами побега может быть ингибирована RTK-специфическими лигандами и антителами, включая эрлотиниб (EGFR-специфическое антитело, одобренное FDA для терапии рака).

В совокупности эти рецепторы и факторы входа обеспечивают потенциальные пути предотвращения инфекции и распространения ВГС при условии, что модуляция их физиологической роли не приводит к значительной токсичности.

После проникновения клетки-мишени через рецептор-опосредованный эндоцитоз частица ВГС подвергается рН-зависимому слиянию мембран в кислом эндосомальном компартменте, чтобы высвободить свой геном РНК в цитоплазму [19,44,45]. Полипротеин ВГС транслируется в грубом ER с положительной цепью РНК ВГС в качестве матрицы, причем трансляция инициируется независимым от cap способом через IRES в 5'NTR. Трансляция ВГС дает один полипротеиновый предшественник длиной приблизительно 3000 аминокислот, который далее обрабатывается клеточными (например, сигнальными пептидазами) и вирусными протеазами (NS2, NS3/4A) для генерации 10 отдельных вирусных белков, включая гликопротеины ядра и оболочки, E1 и E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B.

В ходе полипротеинового процессинга белки ВГС ассоциируются с "мембранной паутиной", которая включает двухмембранные везикулы, содержащие неструктурные белки ВГС, РНК ВГС, ER-мембраны и липидные капли [19,72,73]. Мембранная сеть в клетках, экспрессирующих ВГС, по-видимому, индуцируется ВГС NS4B, возможно, в комбинации с NS5A [74,75]. Считается, что репликация вирусной РНК происходит в этих сетях с геномом положительной цепи РНК в качестве шаблона для NS5B RdRp для генерации отрицательного репликативного промежуточного звена для получения дальнейших положительных смысловых геномов. Зарождающиеся геномы РНК с положительной цепью могут быть дополнительно переведены для получения новых вирусных белков, или служить шаблонами для дальнейшей репликации РНК, или быть собраны в инфекционные вирионы.

В репликации ВГС участвуют различные клеточные факторы, включая циклофилин А и фосфатидилинозитол-4-киназу IIIa (PI4KIIIa). Циклофилин А может модулировать РНК-связывающую способность полимеразы NS5B и взаимодействовать с NS5A. Таким образом, ингибиторы циклофилина оказывают противовирусное действие против ВГС с продолжающимся клиническим развитием [76-80].

Процесс сборки и высвобождения ВГС до конца не изучен. Однако он, по-видимому, тесно связан с липидным обменом. Связь между ВГС и липидным обменом впервые была отмечена в клинической практике на основе жировых изменений в ткани печени, которые в дальнейшем были связаны с ядром ВГС [86]. ВГС-инфекция индуцирует глубокое изменение внутриклеточного распределения липидных капель (ЛДС) от генерализованного цитоплазматического паттерна в неинфицированных клетках до накопления вокруг перинуклеарной области в ВГС-инфицированных клетках, ассоциированных с вирусными белками и геномом [88,89]. Основная ассоциация HCV с LDs, по-видимому, имеет решающее значение для вирусной сборки, и вмешательства, блокирующие это взаимодействие, нарушают выработку вируса [90-92]. Вполне вероятно, что все другие вирусные белки играют ключевую роль в процессе сборки, центрируясь вокруг липидных капель, где сборка запускается в мембранной и богатой липидами среде структурными белками HCV (core/E1/E2/p7/NS2) и репликационным комплексом. Путь секреции липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) тесно связан с путем секреции собранных вирионов [93,94]. Вирион представляет собой липовирочастицу с липидным составом, который напоминает ЛПОНП и ЛПНП с ассоциированными apoE и/или apoB, которые необходимы для сборки инфекционного вируса [93-96]. Клиническое значение имеет то, что гистологические жировые изменения в печени были связаны с клиническими и терапевтическими исходами [97],а генотип ВГС 3, как было показано, опосредует больший стеатоз [98] хотя его патогенетические механизмы, связанные с жизненным циклом ВГС, не ясны. Следует также отметить, что репликацию ВГС можно контролировать с помощью биосинтеза холестерина, а гиполипидемические препараты могут подавлять репликацию ВГС in vitro.

Заключение. Понимание жизненного цикла ВГС и факторов хозяина, препятствующих или способствующих персистированию инфекции, имеет решающее значение для разработки постконтактных и профилактических мер по глобальной борьбе с ВГС. Была диагностирована только часть мировой популяции пациентов, и, несмотря на вышеупомянутые замечательные достижения в области противовирусной терапии, менее 1% из них получили лечение, а те, кто прошел лечение, остаются уязвимыми для повторного заражения. Таким образом, одной терапии недостаточно для устранения глобального бремени ВГС-инфекции и хронических заболеваний печени в ближайшем будущем. Напротив, люди, которые установили успешный иммунный ответ против ВГС, имеют значительную степень защиты при последующем воздействии. Это говорит о том, что эффективные иммунологические стратегии защиты от персистирующей инфекции вполне осуществимы и, вероятно, способен противостоять огромному генетическому разнообразию ВГС.