Преимущество гелевых технологий при определении групп крови

Современные условия труда в централизованной клинико- диагностической лаборатории (ЦКДЛ) требуют выполнения большого количества исследований в минимальные сроки.

Задача статьи - доказать преимущество использования гелевых технологий в работе лабораторий и перейти от рутинной ручной работы к автоматизированным технологиям. Новый этап развития лабораторной диагностики характеризуется постоянным ростом информации, обусловленным совершенствованием лабораторной техники. Повышение качества необходимо на всех этапах исследования: преаналитическом, аналитическом и постаналитическом.

Определение групп крови методом гелевых карт дает возможность сократить время исследования на одного пациента. Использование современных гелевых технологий дает возможность выполнять в рутинной практике набор тестов, ранее доступных только референтным лабораториям, и облегчает работу практикующих врачей.

Ручные методики определения групповой принадлежности имеют недостатки: скорость определения на плоскости значительно снижена, по сравнению с методикой определения на анализаторах крови.

Приказ Министерства здравоохранения РФ от 20.10.2020 г. №1134н «Об утверждении порядка медицинского обследования реципиента, проведение проб на индивидуальную совместимость, включая биологическую пробу, при трансфузии донорской крови и (или) ее компонентов» позволяет регламентировать работу медицинских организаций.    

Правильность определения групповой принадлежности пациентов по системе АВО имеет большое клиническое значение для предотвращения посттрансфузионных осложнений.  К факторам риска относятся в первую очередь ошибки учета образцов и записи результатов, технические ошибки выполнения процедуры (в том числе и технические ошибки лаборатории), однако биологические факторы также имеют значительное влияние на правильность определения АВО. Снижение рисков причинения вреда при переливании несовместимой по системе АВО крови – одно из ведущих направлений в разработке международных и национальных стандартов. Широкое внедрение стандартизации операционных процедур, автоматизации и непрерывной документальной прослеживаемости результатов, позволили сократить количество технических и документальных лабораторных ошибок.

Гелевая технология для иммуногематологических исследований. Задачами лабораторной службы в иммуногематологии являются использование современных методов исследований в лаборатории для определения группы крови по системе АВО. Доказано, что гелевая система является более чувствительной, чем традиционные серологические методы. Гелевый тест позволяет более эффективно использовать рабочее время сотрудников и свести к минимуму значимость результатов реакции от «рук» исполнителя.

Иммуногематологические методы, используемые в клинической лабораторной диагностике:

1. Агглютинация на плоскости с использованием моноклональных антител
2. Агглютинация в пробирках
3. Агглютинация в микропланшетах (объективная регистрация результатов, возможность автоматизации)

Существующие проблемы тестов на плоскости:

-варьирующее качество реагентов, в том числе по сериям;

- отсутствие объективной регистрации результатов и хранения результатов;

- потенциально риск ошибок, связанных с ручным выполнением теста;

-риски инфекционной безопасности персонала и др.

Проблемы традиционных методов иммуногематологических исследований.

1. Объем трудозатрат, невозможность автоматизации
2. Навык чтения результатов специалистами => субъективность в интерпретации слабо-положительных результатов
3. Нестабильность агглютинационной картины
4. Критическая фаза отмывки, ложные слабо-положительные/отрицательные результаты
5. Агглютинационная картина нестабильна, возможно деградация положительного результата
6. Вариабельность результатов, полученных различными исполнителями
7. Вариабельность между лабораториями
8. Определение трудноопределяемых групп крови (табл. 1)

 

Таблица 1

Категории пациентов, у которых встречаются затруднения

при определении основных групп крови АВО.

 

№ п/п	Категория пациентов	Индивидуальные особенности	Характер затруднения	Способ решения проблемы
1.	Новорож-денные	Слабо выражена активность групповых антигенов А и В	Слабо выраженная агглютинация, вероятность пропустить реакцию агглютинации	Использовать прямой метод с цоликлонами анти-А, анти-В, анти-АВ или гелевую методику.
		Отсутствие в сыворотке естественных групповых анти-А, анти-В антител	Отсутствие агглютинации во всех лунках со стандартными эритроцитами АВО при исследовании перекрестным методом
2.	Беременные	Ослабление активности групповых антигенов А и В	Слабо выраженная агглютинация, вероятность пропустить реакцию агглютинации	Использовать различные реактивы в перекрёстном методе
3.	Больные с гематологическими или онкологи-ческими заболеваниями и другими видами патологи-ческих состояний (ожоги, цирроз печени, сепсис и др.)	Ослабление активности или полная утрата групповых антигенов А и В вследствие приема цитостатиков, больших доз гормональных препаратов, радиотерапия, химиотерапия	Слабо выраженная агглютинация или ее отсутствие. Несовпадение результатов исследования, полученных со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками АВО (цоликлонами анти-А, анти-В, анти-АВ) и стандартными эритроцитами АВО.	Использовать различные реактивы в перекрёстном методе. При затруднении направить кровь больного в специализированную лабораторию службы крови.
		Наличие неспецифических алло- и/или аутоантител	Ложно-положительные реакции агглютинации	Использовать перекрёстный метод или гелевую методику. При затруднении направить кровь больного в специализированную лабораторию службы крови.
		Полиагглютинабельность исследуемого образца	Положительные результаты контроля	Использование гелевой методики. При затруднении направить кровь больного в специализированную лабораторию службы крови.
4.	У различных категорий пациентов	Слабые варианты антигена А	Несовпадение результатов исследования, полученных со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками АВО (цоликлонами анти-А, анти-В, анти-АВ) и стандартными эритроцитами АВО.	Использовать цоликлон анти-А1 (лектин) или гелевую методику. При затруднении направить кровь больного в специализированную лабораторию службы крови.
		Массивная гемотрансфузия или трансфузия несовместимых переночсиков газов крови по АВО	Сомнительный результат исследования	Использовать гелевую методику. При затруднении направить кровь больного в специализированную лабораторию службы крови.
		Гиперлипидемия	Возможна неспецифическая агглютинация	Исследуемые эритроциты отмыть. При затруднении направить кровь больного в специализированную лабораторию службы крови.
		Внутривенное введение растворов декстранов или желатина.	Ложноположительные реакции агглютинации и(или) положительный результат контроля (в т.ч. аутоконтроля)	Исследуемые эритроциты отмыть. При затруднении направить кровь больного в специализированную лабораторию.

 

Преимущество гелевой технологии.

 

1. Принцип гель-фильтрации в сочетании с качеством моноклональных антител обеспечивает высокую чувствительность и специфичность метода, все реагенты имеют стандартную дозировку, наличие контроля качества реагентов. Данный метод является референтным при скрининге и идентификации антител, более безопасен для персонала.
2. Простая интерпретация результатов: положительная реакция (сверху геля), отрицательная реакция (внизу геля)
3. Удобен и прост в использовании: сокращение времени исследования в

2 - 5 раз при проведении скрининга антител, проб на совместимость с отсутствием этапа отмывания эритроцитов, с возможностью автоматизированной оценки и фотодокументирования результатов.

4. Быстрая обучаемость персонала.
5. Сводит к минимуму ошибки, встречающиеся при использовании традиционных методик.
6. Результаты теста могут быть фотокопированы для сохранения их в архиве или служить учебным пособием в сложно-диагностируемых случаях.
7. Возможность использования небольших количеств крови – актуально при использование в педиатрии - неонатологии, когда получение достаточных количеств материала (необходимых для других методик) затруднено.
8. Позволяют снизить риск заражения персонала, даже  с потенциально инфицированными образцами.
9. Пластиковые карты сделаны из биоразлагаемого материала, легко утилизируются и не загрязняют окружающую среду.
10. 10)Тест – система стабильна и сохраняется в течение года при комнатной температуре.
11. Единственный метод выявления посттрансфузионных химер!!!

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

1.Быстрое и точное определение группы крови, резус-принадлежности,

в том числе в сложных случаях

2.Широкое типирование антигенов эритроцитов всех известных систем

3.Скрининг и идентификация аллоантиэритроцитарных антител

4.Индивидуальный подбор гемокомпонентов для переливания

5.Диагностика посттрансфузионных осложнений и гемолитической

болезни новорожденных

6.Определение редких антигенов (до 76 различных профилей исследований)

Оборудование и реактивы

• ID-карты для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител;

• ID-центрифуга для центрифугирования карт;

• термостат на +37°С;

• штатив для пробирок и карт;

• пробирки вместимостью 5 и 10 мл;

• пипетки полуавтоматические одноканальные (10, 25, 50 мкл);

• перчатки резиновые хирургические;

• раствор для разведения 1 (раствор бромелина);

• раствор для разведения 2 (раствор низкой ионной силы - LISS, РНИС);

• 0,9% раствор хлорида натрия;

• стандартные типированные эритроциты человека для выявления антител и проведения перекрестной реакции.

Основные группы гелевых тестов

1. Определение группы крови по системе АВО

– Прямой и перекрестный метод, определение подгрупп (доноры, реципиенты, беременные, новорожденные)

2. Определение антигена-D системы Резус

– Определение резус-принадлежности (доноры, реципиенты, беременные, новорожденные)

– Выявление вариантных антигенов (доноры, беременные,

новорожденные)

     3) Фенотипирование

– Определение антигенов С, с, Е, е, К (доноры эритроцитсодержащих

гемкомпонентов, некоторые группы реципиентов)

   4) Скрининг и идентификация антиэритроцитарных антител

– Непрямой метод Кумбса (доноры, реципиенты, беременные)

   5) Проба на совместимость

– Непрямой метод Кумбса (доноры, реципиенты)

   6) Определение АТ на поверхности эритроцитов:

– Прямая проба Кумбса (новорожденные, реципиенты)

Принцип гелевого теста.

Для проведения тестов обычно используются три вида геля:

1) нейтральный, не содержащий специфических антител (применяется для поиска и идентификации антител солевым и ферментативным методами, на холодовой стадии пробы на совместимость крови донора и реципиента);

2) специфический, содержащий антитела (моноклональные или поликлональные) к антигенам эритроцитов крови человека (применяется для типирования антигенов эритроцитов систем АВО, Rh, Kell и т.д.);

3) антиглобулиновый, содержащий антитела (полиспецифические или моноспецифические) к иммуноглобулинам человека и компонентам системы комплемента (применяется для прямого и непрямого антиглобулинового теста, т.е. реакции Кумбса, при поиске и идентификации ауто- и аллоиммунных антител, в пробе на совместимость крови донора и реципиента).

Исследуемые или стандартные эритроциты и исследуемая сыворотка (плазма) помещаются в соответствующие микропробирки, где происходит реакция агглютинации, затем идентификационные карты центрифугируются для разделения результатов реакции. При этом неагглютинированные эритроциты свободно проходят между частицами геля и образуют на дне микропробирки компактный осадок красного цвета - отрицательный результат; агглютинированные располагаются на поверхности или в толще геля (в зависимости от размеров агглютинатов) – положительный результат.

Интерпретация результатов

Оценка результата	Результат
сильно-положительный	(++++) - образовавшиеся агглютинаты эритроцитов задержались на поверхности геля;
положительный	(+++) -агглютинаты располагаются в верхней трети столбика геля;
слабо-положительный	(++) -агглютинаты фиксированы в верхних двух третях геля;
очень слабо-положительный	(+) -агглютинаты располагаются в нижней трети геля;
отрицательный	(-) - эритроциты формируют на дне микропробирки компактный осадок.

 

В современной ЦКДЛ, оснащенной по требованиям  качества и компетентности в лабораторной диагностике, необходимость в использовании современных технологий назрела на начальных этапах становления лаборатории.

Использование гелевых технологий дает возможность выполнить в рамках рутинной практики набор тестов доступных ранее только референтным лабораториям.

ID-гелевые карты – «ЗОЛОТОЙ СТАНДАРТ ИММУНОГЕМАТОЛОГИИ»