СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ В БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ.

Важнейшим разделом современной медицины являются лабораторные исследования, среди которых микробиология, занимает особую роль. Это обусловлено ростом инфекционных заболеваний, бесконтрольностью применения антибактериальных препаратов и антисептиков, широким распространением штаммов микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам расширением спектра микроорганизмов, вызывающих госпитальные инфекции. На сегодняшний день этот раздел диагностики очень востребован во всех видах медицинской помощи. Бактериологическая служба оказывает существенную помощь лечащему врачу в выборе наилучшей схемы лечения инфекционной патологии. Эффективное лечение невозможно без правильной идентификации возбудителя и определения его чувствительности к антимикробным препаратам.

Цель микробиологической диагностики – установить наличие или отсутствие в исследуемом материале возбудителя заболевания и на основании этого расшифровать этиологию заболевания и обосновать соответствующее лечение. 

Задачи микробиологических исследований – идентифицировать микроорганизмы в исследуемом материале, определить их видовую принадлежность, морфологические, биохимические, и токсигенные свойства, а также установить антибиотикочувствительность в выделенных микроорганизмах.

В бактериологической лаборатории ГБУЗ РКИБ КДИЦ г. Стерлитамак используется современнейшее оборудование, которое обладает высокой специфичностью и чувствительностью. 

В последнее десятилетие во всем мире особое значение придается развитию автоматизации микробиологических лабораторий, что позволяет выдавать более точный результат в кратчайшие сроки. С этой целью лаборатории приобретают бактериологические полуавтоматические и автоматические анализаторы, системы для экспресс- диагностики, готовые коммерческие среды. В современных условиях необходима полная автоматизация процесса идентификации микроорганизмов, определения чувствительности к лечебным препаратам с целью скорейшего выздоровления больного. Одним из последних достижений мировой науки в области микробиологии является внедрение в лабораторную практику метода масс- спектрометрии и автоматический бактериологический анализатор культур крови BACT/ALERT 3D.

Существенное сокращение времени затрачиваемого на анализ - подавляющее большинство микроорганизмов выявляется в течение первых суток, отрицательный результат выдается на пятый день;

Вместо субъективных методов определения роста микроорганизмов используется объективный метод, позволяющий зарегистрировать малейшие количества CO2, выделяемого в процессе метаболизма. При этом - четкая дифференциация СО2, выделенного в процессе роста микроорганизмов, от фонового;

Тестирование загруженных в систему флаконов происходит в автономном режиме без контроля оператора и позволяет увеличить производительность лаборатории;

Постоянный мониторинг (каждые десять минут) обеспечивает максимально быстрое и точное выявление положительных образцов;

Немедленное оповещение об обнаруженных позитивных флаконов пятью возможными способами в любой комбинации: - свечение контрольной лампочки возле соответствующей ячейки,

- печатный отчет, 

- сообщение на экране монитора, 

- звуковой сигнал и /или загорание индикатора на контрольной панели прибора - что позволяет оперативно переходить к дальнейшим операциям;

Удобство проведения последующих манипуляций с положительными образцами - широкое горлышко флаконов позволяет продолжать работу без использования шприца;

Наличие специальных флаконов с адсорбирующими полимерными гранулами, инактивирующим действие антибиотиков, позволяют проводить анализ образцов пациентов проходящих курс антибиотикотерапии;

Удобная и гибкая процедура загрузки флаконов в систему - допускается внесение флаконов в любое время и в любую ячейку, а также прединкубированных флаконов;

Для отслеживания и однозначной идентификации флаконов используется штриховое кодирование;

Число манипуляций с флаконами сведено к минимуму;

Благодаря безопасному неинвазивному методу снижается риск перекрестной контаминации;

Внутренний контроль качества и самодиагностика обеспечивают оптимальный режим работы и немедленное выявление проблем возникающих в системе;

При этом BACT/ALERT® 3D определяет следующие группы микроорганизмов: мезофильные аэробные и факультативно- анаэробные микроорганизмы, бактерии группы кишечных палочек (колиформные бактерии), S. aureus и патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы, дрожжи и плесени.

BACT/ALERT® 3D  - автоматический бактериологический анализатор культур крови позволяющие улучшить процесс исследования посева крови на стерильность. Он обеспечивает оптимальные условия для детекции широкого перечня микроорганизмов, включая бактерии и грибы. 

Автоматический анализатор BacT/ALERT использует современные технологии для исследования стерильности культур крови и других биологических жидкостей. Модульная система рассчитана на увеличение производительности при необходимости. Для расширения спектра предлагаемых услуг разработан модуль культивирования микробактерий.
Образцы помещаются в уникальные сверхпрочные пластиковые флаконы, что исключает риск повреждения. Оперативный контроль за аэробными и анаэробными гемокультурами обеспечивают подготовленные флаконы со средой.

В компактном анализаторе BacT/ALERT реализована запатентованная технология идентификации флакона в каждой ячейке. Анализатор автоматически контролирует правильность загрузки считыванием штрих-кода.
Анализатор лидирует по показателям точности результатов среди систем контроля стерильности, демонстрируя самый низкий уровень ложноположительных данных.

- Наличие педиатрических флаконов: рекомендованный объем образца от 0,5 мл.

- Среды с абсорбентами антимикробных препаратов: возможность исследования крови пациентов, уже получаемых антимикробную терапию.

- Флаконы изготовлены из ударопрочного пластика и совместимы с вакуумными системами забора крови.

- Возможность исследования других биологических жидкостей (ликвор, суставная жидкость, плевральная жидкость и прочее).

• Самая компактная система для контроля стерильности крови.
• Система состоит из анализатора, монитора и сканера штрих- кодов.
• Интуитивный графический интерфейс.
• Возможность включения в ЛИС.

BACT/ALERT представляет собой базовое программное обеспечение.

Пять настраиваемых полей данных могут быть использованы для внесения информации о пациенте или об исследуемом образце. Отчеты могут формироваться на основе данных, либо на основе результатов исследования. 

BACT/ALERTобладает:

- Высокой чувствительностью исследования: детекция микроорганизмов уже от 4-х клеток патогена во флаконе.

- Максимальной загрузкой: 120 флаконов.

- Время исследования (цикла): Протокол (максимальное время нахождения флаконов в анализаторе): 5 суток.

- Среднее время выявление роста микроорганизма: 8-10 часов.

- Фасовка (кол-во флаконов в упаковке): 100.

- Возможность свободной дозагрузки прибора во время работы: есть.

                                                      

Безопасность:

- Уменьшение риска ошибок: управляемая оператором загрузка флаконов с одновременной автоматической идентификацией;

- Многовариантный алгоритм: быстрое определение микроорганизмов;

- Один из самых низких уровней ложноположительных результатов среди всех систем контроля стерильности. 

Особенности

- Каждая ячейка для флакона оборудована запатентованным устройством опознания для немедленной идентификации флакона при его загрузке в анализатор и для автоматического контроля качества.

- Непрерывный мониторинг обеспечивает немедленное оповещение при получении результата с возможностью использования визуальных и звуковых сигналов, а также удаленной сигнализации.

- Управляемая оператором загрузка флаконов существенно оптимизирует процесс работы.

- Оператор контролирует систему через графический (без использования текста) интерфейс, реализованный через сенсорный экран, и просто сканирует штрих-код флакона перед его загрузкой в прибор. 

Среды для выделения микроорганизмов к автоматическим бактериологическим анализатором культур крови и микробактерий серии BacT/ALERT 3D. 

-Универсальные среды позволяют выделять микроорганизмы из образцов разного типа, включая кровь и другие в норме стерильные биологические жидкости.

-Колориметрический метод детекции с использованием тщательно разработанных алгоритмов позволяют минимизировать количество ложноотрицательных результатов.

-Представлены стандартная среда и специализированная среда с Усиленной нейтрализацией антибиотиков. 

-В дно каждого флакона со средой встроен специальный колориметрический датчик. При росте микроорганизмов во флаконе выделяется углекислый газ, под действием которого сенсор меняет цвет. Анализатор BacT/ALERT измеряет  изменение цвета каждые 10 минут и анализирует эти изменения. Многопараметрические алгоритмы, в том числе уникальный "пороговый"  алгоритм, позволяет зарегистрировать микробный рост в максимально ранние сроки. Даже при условии отсроченной загрузки флаконов, визуальная оценка изменения цвета дна флакона позволяет предварительно идентифицировать положительный флакон даже до загрузки его в прибор.

 

После изьятия из анализатора BacT/ALERT флаконы с положительными образцами берутся для дальнейшей идентификации микроорганизмов, на анализаторе Масс- спектрометр MALDI-TOF BactoSCREEN.

Метод  масс-спектрометрии позволяет значительно сократить время идентификации бактериальной микрофлоры.

На базе масс-спектрометра научно-производственной организацией «Литех» была создана первая отечественная система масс-спектрометрической идентификации микроорганизмов и изучения их чувствительности к антибиотикам - микробиологический анализатор BactoSCREEN. Все исследования, проводимые в микробиологических лабораториях должны осуществляться согласно унифицированным методикам по выделению чистых культур. 

Данное оборудование позволяет нам проводить контроль качества каждого этапа лабораторного исследования, стандартизацию реагентов, схем и методик, применяемых в лабораторных  микробиологических исследованиях.

В основе системы идентификации используется алгоритм, позволяющий быстро и точно производить идентификацию микроорганизмов по их белковому спектру. Идентификация в BactoSCREEN происходит по рибосомальным белкам, которые являются уникальными для любых микроорганизмов. Биоинформационное программное обеспечение позволяет надёжно и точно проводить видовую идентификацию микроорганизмов путём сопоставления получаемых масс-спектров бактерий с базой данных BactoSCREEN, которая содержит сведения о более, чем 2300 видах микроорганизмов всех типов: бактерий, микобактерий, мицелиальных и дрожжевых грибов.

Новая технология позволяет избежать предварительной длительной пробоподготовки и определяет спектр белков напрямую из бактериальной колонии, взятой с чашки первичного посева материала.                                                  

Масс-спектрометрия – метод идентификации молекул путем измерения отношения их массы к заряду в ионизированном состоянии.
           MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption'lonization) – ионизация вещества с помощью матрицы и лазерного излучения.
         TOF MS (Time of Flight Mass-Spectrometry) – время пролетная масс-спектрометрия. Масса молекулы оценивается по времени пролета от источника ионизации до детектора.

Для каждого вида микроорганизмов сформирован характерный набор белков (биомаркеров), полученный на основе анализа не менее 50 масс-спектров этого вида, каждый образец тщательно идентифицирован. Структурированная таким образом база данных позволяет быстро и точно идентифицировать микробиологические штаммы. 

Вся методика идентификации состоит из 2-х этапов:
Этап1:Подготовка образца
Этап 2: Идентификация.
          Образец помещают в прибор и подвергают воздействию наносекундных лазерных импульсов. При этом молекулы матрицы и аналита (белки) переходят в газовую фазу, а протонированные молекулы матрицы взаимодействуют с белками, перенося на них положительный заряд. Под действием электрического поля ионизированные белки движутся от источника ионизации к детектору с ускорениями, обратно пропорциональными их атомным массам. Программное обеспечение прибора оценивает время пролета частиц и преобразует эту информацию в спектр молекулярных масс (масс-спектр). Масс-спектр сравнивается со спектрами из базы данных и на основании сведений о массах происходит идентификация микроорганизмов. Затраты по времени для идентификации 24 изолятов – 12 минут, для 96 изолятов – 43 минуты.

В новом оборудовании оптимизирована загрузка образцов: микроорганизмы наносятся на слайд, добавляется матрикс и запускается процесс анализа. Расходные материалы поставляются с готовым к использованию, устойчивым на свету раствором матрикса, что экономит время на подготовку реагентов. Для каждого вида микроорганизмов в базе данных присутствуют спектры большого количества штаммов.

Таким образом, на идентификацию одного микроорганизма требуется меньше 2-х минут времени, при этом материалом может служить первичная колония. Однако метод масс-спектрометрии не может быть использован для определения чувствительности бактерий к антимикробным агентам. 

За 6 мес период 2021-22гг нами было проанализированы результаты бактериологических исследований более 3000 образцов мокроты и 2360 крови на стерильность у госпитаных больных находившихся на лечении с диагнозом Covid-19. 

В микробном пейзаже бактериальной флоры мокроты у пациентов в большинстве случаев преобладали грамотрицательные бактерии – 63%, грамположительная флора - 10%, грибы – 27%. 

Среди грамотрицательных бактерий были выявлены различные виды, но в большинстве своем преобладают такие как  Acinetobacter baumannii – 41% и Klebsiella pneumonia – 43%, а реже были зарегистрированы Pseudomonas aeruginosa – 23%. 

Грамположительная микрофлора была выявлена в 53% случаях Streptococcus, который был выявлен в 2 видах: Str. pneumoniae – 26%, Str.viridans – 18% , Rothia mucilaginosa – 31% , Moraxella sp – 24% и Staphilococcus aureus – 20%.

 Выявленные грибы в мокроте в большинстве своем (93%) были идентифицированы как C.albicans.

При исследовании мокроты у пациентов в реанимационном отделении основную долю выделенных микроорганизмов составляли грибы рода Candida – 78%, Acinetobacter baumannii – 54% и Klebsiella pneumonia – 46%. 

Анализируя статистические данные, полученные при исследовании крови на стерильность, мы обнаружили рост микрофлоры в 43% . Из них были идентифицированы такие бактерии как Acinetobacter baumannii – 44% , Klebsiella pneumonia – 47%, Staphilococcus aureus - 9%.

Также выделенные штаммы микроорганизмов обладают высокой резистентностью к антимикробным препаратам.

Делая выводы, автоматизированные методы микробиологических исследований в сравнении с традиционными  методами позволяют улучшить качество работы лаборатории, а также значительно сократить сроки выдачи готовых результатов, что позволяет улучшить качество работы лаборатории.