ПРЕИМУЩЕСТВО МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В ДИАГНОСТИКЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ ВИРУСОМ ЭПШТЕЙНА-БАРР

Вирус Эпштейна-Барр остаётся одним из наиболее распространённых патогенов человека, инфицирующим более 90% взрослого населения. Молекулярно-генетические методы диагностики заболеваний, ассоциированных с этим возбудителем, претерпели существенную трансформацию за последние годы.

 

Вирус Эпштейна-Барр представляет собой ДНК-содержащий вирус семейства Herpesviridae, который обладает уникальной способностью к пожизненной персистенции в организме инфицированного человека [2]. По данным российских эпидемиологических исследований, к 25-летнему возрасту серопозитивность к ВЭБ достигает 92-95% [5]. Первичная инфекция чаще всего протекает в форме инфекционного мононуклеоза. Однако клинический спектр ВЭБ-ассоциированной патологии значительно шире и включает хроническую активную инфекцию, лимфопролиферативные заболевания, назофарингеальную карциному.

 

Традиционная серологическая диагностика, основанная на определении антител различных классов к структурным и неструктурным белкам вируса, длительное время оставалась основным методом лабораторного подтверждения инфекции. Однако данный подход имеет существенные ограничения. У пациентов с иммунодефицитными состояниями антительный ответ может быть недостаточным или атипичным. Новорождённые и дети первых месяцев жизни несут материнские антитела, что затрудняет интерпретацию серологических тестов. Реактивация латентной инфекции не всегда сопровождается характерными изменениями серологического профиля [3].

 

Масштабные клинические наблюдения последних лет показывают растущую частоту атипичных и хронических форм ВЭБ-инфекции. В структуре инфекционной патологии детского возраста на долю ВЭБ-ассоциированных заболеваний приходится до 18% всех случаев длительной лихорадки неясного генеза. У реципиентов трансплантатов и ВИЧ-инфицированных пациентов реактивация вируса может приводить к развитию посттрансплантационных лимфопролиферативных расстройств с летальностью до 60% при отсутствии своевременной терапии [1].

 

Эти обстоятельства обусловили необходимость внедрения в клиническую практику молекулярно-генетических методов. Прямое определение вирусной ДНК позволяет преодолеть ограничения серологии и получить качественно новую информацию о состоянии инфекционного процесса. Начиная с 2020 года в российских клинико-диагностических лабораториях отмечается увеличение доли молекулярных исследований на ВЭБ более чем в 2,3 раза [6].

 

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) составляет методологическую основу современной молекулярной диагностики герпесвирусных инфекций. Технология базируется на многократной амплификации специфических фрагментов вирусной ДНК с использованием термостабильной полимеразы и праймеров, комплементарных консервативным участкам генома возбудителя [4].

 

Для диагностики ВЭБ-инфекции, а именно обнаружения ДНК вируса, использовался амплификатор с детекцией в режиме реального времени LOCUS Intero 6. Качественная ПЦР даёт ответ о наличии или отсутствии вирусной ДНК в исследуемом биоматериале. Этот подход применим для подтверждения активной инфекции.

 

Количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) представляет более информативный метод. Определение вирусной нагрузки — концентрации копий ДНК ВЭБ в единице объёма крови — открывает возможности для динамического мониторинга инфекционного процесса [2]. Значения вирусной нагрузки выше 10⁵ копий/мл в цельной крови с высокой вероятностью указывают на клинически значимую активную инфекцию [5].

 

В качестве мишеней для амплификации использовали гены EBNA-1, BALF5 (кодирует ДНК-полимеразу) и LMP1. Выбор целевого локуса определяет чувствительность и специфичность анализа. Ген EBNA-1 присутствует в геноме в одной копии на вирион, что обеспечивает точную количественную оценку. Ген BALF5 высококонсервативен среди различных штаммов ВЭБ, что минимизирует риск ложноотрицательных результатов [7].

 

Выбор подходящего биологического образца для анализа имеет большое значение. Цельная кровь является ценным материалом, поскольку в ней присутствуют как вирусные частицы, находящиеся внутри пораженных лимфоцитов, так и свободные вирионы, циркулирующие в плазме. Такая комбинация делает ее идеальным выбором для диагностики генерализованной инфекции. Плазма или сыворотка, напротив, чаще применяются для наблюдения за пациентами, перенесшими трансплантацию. В этих случаях раннее выявление вирусной нагрузки в крови имеет решающее значение, так как оно может указывать на риск развития посттрансплантационных лимфопролиферативных заболеваний [3].

 

Слюна - ещё один перспективный материал, учитывая, что ротоглотка служит основным местом репликации и выделения ВЭБ. Концентрация вирусной ДНК в слюне может быть выше, чем в крови, особенно в ранние сроки первичной инфекции. Тем не менее, корреляция между вирусной нагрузкой в слюне и клиническими проявлениями прослеживается не всегда чётко [6].

 

По данным исследования, которое проводилось на базе ООО Диагностического центра «Луганская Диагностическая Лаборатория» в Луганской Народной Республике, были взяты биологические материалы у 1718 пациентов мужского и женского пола от 3 до 60 лет, которые обратились по результатам клинической картины (статуса) и направления лечащего врача, с целью проведения обследования и получения консультативной помощи.

 

На основе статистической оценки было проанализировано 1600 проб слюны и крови, направленных исключительно на ПЦР-тестирование. Дополнительно, 1006 образцов были исследованы только на наличие инфекционных маркеров, а 118 образцов подверглись комплексному анализу, включающему как ПЦР исследование, так и проверку на инфекционные маркеры. Полученные данные позволяют заключить, что выявление вирусных ДНК-копий представляет собой наиболее точный и ключевой подход в диагностике инфекций, вызванных вирусом Эпштейна-Барр. Идентификация генокопий в организме пациента служит первоосновой для последующего углубленного изучения, включая определение уровня антител и установление стадии развития заболевания.

 

Практическая ценность молекулярной диагностики наиболее отчётливо проявляется в нескольких клинических ситуациях. Первая - подтверждение острого инфекционного мононуклеоза на ранних стадиях, когда серологические маркеры ещё отсутствуют или неинформативны. Обнаружение ДНК ВЭБ в крови методом ПЦР возможно уже на 3-5 день заболевания, тогда как IgM к VCA появляются в среднем на 7-10 день [7].

 

У детей раннего возраста, где материнские антитела маскируют истинный инфекционный статус, ПЦР становится методом выбора. Исследование продемонстрировало, что у 34% детей первого года жизни с клиникой острой респираторной инфекции и лимфаденопатией была выявлена ДНК ВЭБ в крови при отсутствии специфических IgM [3].

 

Мониторинг реципиентов трансплантатов составляет второе важное направление. Регулярное количественное определение ДНК ВЭБ в крови (обычно еженедельно в первые три месяца после трансплантации) позволяет выявить начало реактивации до развёрнутой клинической картины посттрансплантационного лимфопролиферативного заболевания. Пороговые значения вирусной нагрузки, требующие коррекции иммуносупрессивной терапии или назначения противовирусных препаратов, варьируют в зависимости от типа трансплантации, но обычно составляют 10⁴-10⁵ копий/мл [1].

 

Обнаружение низких концентраций ДНК ВЭБ (менее 10³ копий/мл) в крови клинически здоровых лиц встречается у 5-15% обследованных и отражает физиологическую циркуляцию инфицированных В-лимфоцитов [6], что является сложным аспектом интерпретации данных — разграничение латентной инфекции, бессимптомного носительства и клинически значимой репликации.

 

Динамическое наблюдение здесь информативнее однократного исследования. Нарастание вирусной нагрузки в 10 и более раз за 1-2 недели, даже при исходно низких значениях, служит надёжным индикатором активации инфекционного процесса [2]. У пациентов с хронической активной ВЭБ-инфекцией персистирующая высокая вирусная нагрузка (более 10⁴ копий/мл) сохраняется в течение нескольких месяцев [5].

 

Стандартизация количественной ПЦР при ВЭБ остаётся нерешённой проблемой. Результаты, полученные с использованием различных тест-систем, могут различаться в несколько раз. Международный стандарт ВОЗ для калибровки количественных методов был введён в 2011 году, но его применение в российских лабораториях не стало повсеместным [1]. Выражение результатов в международных единицах (МЕ/мл) вместо копий/мл частично решает проблему сопоставимости данных.

 

Комбинированное использование серологических и молекулярных методов обеспечивает наиболее полную диагностическую картину. Серология отражает иммунологическую фазу инфекции, молекулярные тесты — вирусологическую. Их сочетание особенно информативно при атипичных и хронических формах ВЭБ-инфекции.

 

Молекулярно-генетические методы, прежде всего количественная ПЦР в реальном времени, кардинально изменили подходы к диагностике заболеваний, вызванных вирусом Эпштейна-Барр. Прямое обнаружение вирусной ДНК и определение вирусной нагрузки преодолевают ограничения традиционной серологии, обеспечивая раннюю диагностику, возможность мониторинга активности инфекционного процесса и оценку эффективности терапии.

 

Клиническая значимость молекулярной диагностики особенно велика у иммунокомпрометированных пациентов, реципиентов трансплантатов, детей раннего возраста, при ВЭБ-ассоциированных онкологических заболеваниях. Регулярное количественное определение ДНК вируса позволяет своевременно выявлять реактивацию инфекции и предотвращать жизнеугрожающие осложнения.

 

Интерпретация результатов молекулярных тестов требует учёта клинического контекста, иммунного статуса пациента, типа исследуемого биоматериала. Обнаружение низких концентраций ДНК ВЭБ в крови не всегда свидетельствует о клинически значимой инфекции. Динамическое наблюдение информативнее однократного исследования.

 

Нерешённой остаётся проблема стандартизации количественных методов и унификации пороговых значений вирусной нагрузки для различных клинических ситуаций. Необходима разработка национальных клинических рекомендаций с чёткими алгоритмами применения молекулярной диагностики.

 

Перспективы развития связаны с внедрением технологий секвенирования нового поколения, экспресс-методов изотермической амплификации, портативных анализаторов для тестирования в формате «point-of-care», алгоритмов искусственного интеллекта для интерпретации результатов. Сочетание серологических и молекулярных методов в рамках комплексной лабораторной диагностики обеспечит наиболее полную характеристику инфекционного процесса и оптимизирует тактику ведения пациентов с ВЭБ-инфекцией.